本发明属于油脂中胆固醇的提取方法及胆固醇含量的自动分析方法。(1)将油脂加入正己烷溶解;(2)溶解后加入硅胶固相萃取小柱吸附,用两种不同配比的正己烷和乙醚溶液净化萃取胆固醇;(3)用旋转蒸发仪干燥,浓缩后加显色液邻苯二胺冰乙酸溶液溶制成分析样品;(4)用流动注射自动分析仪分别测定分析样品的基线、试样曲线;(5)用流动注射自动分析仪测定已知胆固醇浓度的标样谱图;(6)将试样谱图与标样谱图比较,计算出试样中的胆固醇含量。优点:提取胆固醇的精度和速度优于皂化法提取,测定精度和速度优于分光光度法,显色液与检测波长相配合,提高了对胆固醇的测定精确度。
1.油脂中胆固醇含量分析样品的制备方法,包括如下步骤:(1)将油脂充分混匀后取0.5g~1.5g,加入5mL~15mL正己烷至油脂被完全溶解,涡旋混匀后得到油脂溶液;(2)将油脂溶液加入硅胶固相萃取小柱,从该小柱的底部孔弃去流出液;再用体积比为正己烷:乙醚=98:2的淋洗液5mL~10mL加入到硅胶固相萃取小柱中,从该小柱的底部孔弃去流出液;最后用体积比为正己烷:乙醚=92:8的淋洗液20mL~50mL加入到硅胶固相萃取小柱中,从该小柱的底部孔收集流出液备用;(3)将上述(2)步骤的备用收集流改于旋转蒸发仪干燥,旋转蒸发仪在真空度300KPa~500KPa,温度为40°C~50°C条件下将所述的收集流浓缩至10μL~50μL,将浓缩的收集流与5mL~10mL显色液溶解制得胆固醇分析样品;所述的显色液是重量/体积比例为邻苯二胺(g):冰乙酸(L)=0.03g/L~0.06g/L的溶液。
2.油脂中胆固醇含量的测定方法,包括如下步骤:(1)溶解:将油脂充分混匀后取0.5g~1.5g,加入5mL~15mL正己烷至油脂被完全溶解,涡旋混匀后得到油脂溶液;(2)萃取:将油脂溶液加入硅胶固相萃取小柱,从该小柱的底部孔弃去流出液;再用体积比为正己烷:乙醚=98:2的淋洗液5mL~10mL加入到硅胶固相萃取小柱中,从该小柱的底部孔弃去流出液;最后用体积比为正己烷:乙醚=92:8的淋洗液20mL~50mL加入到硅胶固相萃取小柱中,从该小柱的底部孔收集流出液备用;(3)浓缩并作色:将上述(2)步骤的备用收集流改于旋转蒸发仪干燥,转蒸发仪在真空度300KPa~500KPa,温度为40°C~50°C条件下将所述的收集流浓缩至10μL~50μL,将浓缩的收集流与5mL~10mL显色液溶解制得胆固醇分析样品;所述的显色液是重量/体积比为邻苯二胺(g):冰乙酸(L)=0.03g/L~0.06g/L的溶液;胆固醇分析样品作为下述流动注射自动分析仪测定中的试样S;(4)测基线:将流动注射自动分析仪设置在进样状态,进样阀V设置在分析状态;在低压泵P的作用下,反应液R经显色液流路,推动液C经推动液流路后,使反应液R和推动液C在三通混合器M相混合形成混合液,反应液R和推动液C的混合液经冷却反应器L进入光学流通池F,经光学检测器D将反应混合液特征的信号传输给计算机处理系统PC处理,得到基线;在基线测绘的同时,使试样S经样品流路和进样阀V进入进样环C₀并将进样环充满;(5)测试样:将流动注射自动分析仪转换至分析状态,使进样环C₀中的试样S在推动液C的推动下进入分析流路,使试样S进入分析流路;在分析流路中,试样S与反应液R在三通混合器M混合后,在冷却反应器L中发生反应,在此过程中形成有色物质,继而该有色物质进入光学流通池F,经光学检测器D将该有色物质特征的信号传输给计算机处理系统PC处理,得到试样谱图。
3.根据权利要求2所述的油脂中胆固醇含量的测定方法,其特征在于,所述的硅胶固相萃取小柱型号为DIKMAProElutSI,在6mL的试管中有500mg固体硅胶粉;所述的冷却反应器L是内径为1.0mm聚四氟乙烯螺旋状盘管,冷却方式为循环水冷却。技术领域
本发明属胆固醇含量检测术领域,特别涉及油脂中胆固醇的提取方法及胆固醇含量的自动分析方法。
背景技术
胆固醇(Cholesterol)是一种环戊烷多氢菲的衍生物。胆固醇作为一种营养素具有重要的生理功能,但是长期大量摄入,可能加大患动脉粥样硬化、高血压和冠心病等心血管疾病的风险。目前,油脂的营养价值、品质和质量越来越受到消费者的重视。油脂中胆固醇的含量可作为鉴定油脂营养价值和品质的一个重要指标,检测油脂中胆固醇的含量也是鉴别地沟油的重要手段之一。而目前,在检测油脂中胆固醇含量的过程中,样品前处理采用油脂皂化处理步骤繁琐、样品处理时间长、溶剂用量大,提取率低;皂化法提取精度仅达95%,有5%的胆固醇难以提取,即有5%的误差;皂化法提取胆固醇需要3小时以上。目前检测胆固醇含量方法中分光光度计法操作繁琐、手动添加试剂、人为操作误差大,且耗时。高效液相色谱和气相色谱等设备费及运行成本高。现在测定胆固醇的分光光度法精度仅能达到2%,分光光度法的分析时间需要1h。
发明内容
本发明提供了精确度更高、时间更短的从油脂中提取胆固醇试样的方法,以及精确度更高、时间更短的胆固醇含量自动分析方法。本发明所述油脂中胆固醇的提取方法,使用硅胶固相萃取小柱的型号为DIKMAProElutSI进行固相萃取法。油脂中胆固醇含量分析样品的制备方法,包括如下步骤:(1)将油脂充分混匀后取0.5g~1.5g,加入5mL~15mL正己烷至油脂被完全溶解,涡旋混匀后得到油脂溶液;(2)将油脂溶液加入硅胶固相萃取小柱,从该小柱的底部孔弃去流出液;再用体积比为正己烷:乙醚=98:2的淋洗液5mL~10mL加入到硅胶固相萃取小柱中,从该小柱的底部孔弃去流出液;最后用体积比为正己烷:乙醚=92:8的淋洗液20mL~50mL加入到硅胶固相萃取小柱中,从该小柱的底部孔收集流出液备用;(3)将上述(2)步骤的备用收集流改于旋转蒸发仪干燥,转蒸发仪在真空度300KPa~500KPa,温度为40°C~50°C条件下将所述的收集流浓缩至10μL~50μL,将浓缩的收集流与5mL~10mL显色液溶解制得胆固醇分析样品;所述的显色液是重量/体积比为邻苯二胺(g):冰乙酸(L)=0.03g/L~0.06g/L的溶液。本发明所述的胆固醇含量分析方法是采用流动注射自动分析法,流动注射自动分析方法使用包括有样品流路、推动液流路、显色液流路、低压泵P、进样阀V、进样环C₀、冷却反应器L、反压圈Y、三通混合器M、分析流路、光学流通池F、光学检测器D和计算机处理系统PC的分析仪器。关于正己烷:乙醚=98:2(V:V=98:2)淋洗液的用量与淋洗效果:在已知胆固醇含量(300mg/kg)的油脂中提取胆固醇含量,称取油脂质量为1.0g的五个试样,加入5mL~15mL正己烷至油脂被完全溶解,涡旋混匀后分别得到五个油脂溶液;淋洗液正己烷:乙醚=98:2(V:V=98:2)分别采用五个不同的体积为5mL、10mL、15mL、20mL、30mL,用五个淋洗液分别对五个油脂溶液淋洗;洗脱液中检测出胆固醇的量变化很大,如下,说明用5mL~10mL不同体积的淋洗液对试样淋洗可分离出胆固醇,即保留胆固醇在硅胶固相萃取小柱中,等待用专门洗脱胆固醇的淋洗液洗脱。用5mL(V:V=98:2)淋洗液的未检出胆固醇;用10mL(V:V=98:2)淋洗液的未检出胆固醇;用15mL(V:V=98:2)淋洗液的检出胆固醇含量为2.5mg/L;用20mL(V:V=98:2)淋洗液的检出胆固醇含量为4.0mg/L;用30mL(V:V=98:2)淋洗液的检出胆固醇含量为6.0mg/。但用20mL~50mL正己烷:乙醚=92:8(V:V=92:8)的淋洗液加入到已经用5mL~10mL正己烷:乙醚=98:2(V:V=98:2)淋洗过的硅胶固相萃取小柱中洗脱胆固醇,洗脱即提取胆固醇的量高达98.38%,则提取胆固醇试样的精度高达1.62%。油脂中胆固醇含量的测定方法,包括如下步骤:(1)溶解:将油脂充分混匀后取0.5g~1.5g,加入5mL~15mL正己烷至油脂被完全溶解,涡旋混匀后得到油脂溶液;(2)萃取:将油脂溶液加入硅胶固相萃取小柱,从该小柱的底部孔弃去流出液;再用体积比为正己烷:乙醚=98:2的淋洗液5mL~10mL加入到硅胶固相萃取小柱中,从该小柱的底部孔弃去流出液;最后用体积比为正己烷:乙醚=92:8的淋洗液20mL~50mL加入到硅胶固相萃取小柱中,从该小柱的底部孔收集流出液备用;(3)浓缩并作色:将上述(2)步骤的备用收集流改于旋转蒸发仪干燥,转蒸发仪在真空度300KPa~500KPa,温度为40°C~50°C条件下将所述的收集流浓缩至10μL~50μL,将浓缩的收集流与5mL~10mL显色液溶解制得胆固醇分析样品;所述的显色液是重量/体积比为邻苯二胺(g):冰乙酸(L)=0.03g/L~0.06g/L的溶液;胆固醇分析样品作为下述流动注射自动分析仪测定中的试样S;(4)测基线:将流动注射自动分析仪设置在进样状态,进样阀V设置在分析状态;在低压泵P的作用下,反应液R经显色液流路,推动液C经推动液流路后,使反应液R和推动液C在三通混合器M相混合形成混合液,反应液R和推动液C的混合液经冷却反应器L进入光学流通池F,经光学检测器D将反应混合液特征的信号传输给计算机处理系统PC处理,得到基线;在基线测绘的同时,使试样S经样品流路和进样阀V进入进样环C₀并将进样环充满;(5)测试样:将流动注射自动分析仪转换至分析状态,使进样环C₀中的试样S在推动液C的推动下进入分析流路,使试样S进入分析流路;在分析流路中,试样S与反应液R在三通混合器M混合后,在冷却反应器L中发生反应,在此过程中形成有色物质,继而该有色物质进入光学流通池F,经光学检测器D将该有色物质特征的信号传输给计算机处理系统PC处理,得到试样谱图;(6)使用一系列已知胆固醇浓度的标样代替试样S,重复上述步骤(4)和(5),得到一系列标样谱图,以标样的浓度x为横坐标、以标样谱图的峰高y为纵坐标绘制回归方程曲线;(7)将所绘制的试样谱图与标样谱图比较,通过所述标样工作曲线的回归方程计算出试样S中的胆固醇含量。油脂中胆固醇含量的测定方法所述的硅胶固相萃取小柱型号为DIKMAProElutSI,在6mL的试管中有500mg固体硅胶粉;所述的冷却反应器L是内径为1.0mm聚四氟乙烯螺旋状盘管,冷却方式为循环水冷却;所述的反压圈Y为内径为0.5mm聚四氟乙烯螺旋状盘管,光学检测器D的检测波长为410nm~415nm。上述测定方法中,推动液C、反应液R的优化配方为:硅胶固相萃取小柱的型号为DIKMAProElutSI,生产厂为迪马科技有限公司;推动液C是浓度为0.1mol/L~0.4mol/L的硫酸;反应液R是浓度为10mol/L~15mol/L的硫酸;光学流通池F的光程为18mm~25mm;冷却反应器L为内径为1.0mm聚四氟乙烯螺旋状盘管,冷却方式为循环水冷却,冷却反应后的液体;反压圈Y为内径为0.5mm聚四氟乙烯螺旋状盘管,反应液与试样反应过程中产生热,易产生气泡,设置反压圈Y增加废液W出口的排除压力,抑制气泡产生。本发明具有以下有益效果:1、提取的优点:本发明从油脂中提取胆固醇试样的精度高达1.62%,提取仅需15分钟,而且节约试剂,比皂化法提取胆固醇减少人力和耗材。2、测定的优点:本发明用流动注射自动分析法测定精度高到0.56%,本发明的分析时间仅需3分钟。现在测定胆固醇的分光光度法精度仅能达到2%,分光光度法的分析时间需要1h。3、对流动注射自动分析仪设计了测基线和测试样两个回路,该两个回路设计成只要转动进样阀V就能实现两个回路转换,从而实现了分析测定的自动化。4、用重量/体积比为邻苯二胺(g):冰乙酸(L)=0.03g/L~0.06g/L的溶液作为显色液,与光学检测器D的检测波长410nm~415nm相配合,提高了用光学检测器D对胆固醇的测定精确度。5.本发明所述方法完全能满足油脂中胆固醇测定的灵敏度和准确性要求,其最低检测限为0.2mg/L,线性范围为2mg/L~100mg/L,得到线性回归方程为y=3.3655x+78.658,R²=0.9991。3.方法学验证:对精密度的验证,取已知浓度的胆固醇标准溶液,按照确定的分析条件测定其峰高,重复测定11次,分析计算RSD值为0.56%;对重现性的验证,精确称取样品5份,按上述前处理方法制备供试样品,按照确定的自动分析方法条件进行进样分析,测定其峰高,分析计算RSD值为2.11%;对加标回收率实验的验证,取已知胆固醇含量的样品5份,分别准确加入一定量胆固醇标准溶液,按上述前处理方法制备供试样品,按照确定的自动分析方法条件进行进样分析,测定其峰高,计算加标回收率为90.2%~102.8%,平均回收率为97.1%。
附图说明
图1是本发明将流动注射自动分析仪设置在测基线状态的工艺流程图;图2将图1中的流动注射自动分析仪设置在测试样状态的工艺流程图;图3本发明所述胆固醇标样的回归方程曲线。图中,P—低压泵、V—进样阀、C₀—进样环、PC—计算机处理系统、D—光学检测器、F—光学流通池、L—冷却反应器、M—三通混合器、S—试样、R—反应液、W—废液、Y—反压圈。
具体实施方式
实施例1:油脂中胆固醇含量分析样品的制备方法油脂中胆固醇含量分析样品的制备方法,包括如下步骤:(1)将过滤去除固体杂质和水分的地沟油充分混匀,精确称取0.8g地沟油样品于配有螺旋塞的离心管中,加入8mL正己烷,涡旋混匀后得到油脂溶液;(2)将油脂溶液加入硅胶固相萃取小柱,从该小柱的底部孔弃去流出液;再用10mL体积比为正己烷:乙醚(V:V=98:2)溶液淋洗,弃去流出液;最后用40mL体积比为正己烷:乙醚(V:V=92:8)溶液淋洗,收集流出液备用;硅胶固相萃取小柱的型号为DIKMAProElutSI,生产厂为迪马科技有限公司。(3)将上述(2)步骤的备用收集流改于旋转蒸发仪干燥,转蒸发仪在真空度400KPa,温度为45°C条件下将所述的收集流浓缩至20μL,将浓缩的收集流与5mL显色液溶解制得胆固醇含量分析样品;所述的显色液是重量/体积比为邻苯二胺(g):冰乙酸(L)=0.05g/L的溶液。实施例2:地沟油中胆固醇含量的测定方法油脂中胆固醇含量的测定方法,包括如下步骤:(1)将过滤去除固体杂质和水分的地沟油充分混匀,精确称取0.8g地沟油样品于配有螺旋塞的离心管中,加入8mL正己烷,涡旋混匀后得到油脂溶液。(2)将油脂溶液加入硅胶固相萃取小柱,从该小柱的底部孔弃去流出液;再用10mL体积比为正己烷:乙醚(V:V=98:2)溶液淋洗,弃去流出液;最后用40mL体积比为正己烷:乙醚(V:V=92:8)溶液淋洗,收集流出液备用。硅胶固相萃取小柱的型号为DIKMAProElutSI,生产厂为迪马科技有限公司。(3)将上述(2)步骤的备用收集流改于旋转蒸发仪干燥,转蒸发仪在真空度400KPa,温度为45°C条件下将所述的收集流浓缩至20μL,将浓缩的收集流与5mL显色液溶解制得胆固醇含量分析样品;所述的显色液是重量/体积比为邻苯二胺(g):冰乙酸(L)=0.05g/L的溶液。(4)测基线:将流动注射自动分析仪设置在进样状态,进样阀V设置在分析状态;在低压泵P的作用下,反应液R经显色液流路,推动液C经推动液流路后,使反应液R和推动液C在三通混合器M相混合形成混合液,反应液R和推动液C的混合液经冷却反应器L进入光学流通池F,经光学检测器D将反应混合液特征的信号传输给计算机处理系统PC处理,得到基线;在基线测绘的同时,使试样S经样品流路和进样阀V进入进样环C₀,并将进样环充满;(5)测试样:将流动注射自动分析仪转换至分析状态,使进样环C₀中的试样S在推动液C的推动下进入分析流路,使试样S进入分析流路;在分析流路中,试样S与反应液R在三通混合器M混合后,在冷却反应器L中发生反应,在此过程中形成有色物质,继而该有色物质进入光学流通池F,经光学检测器D将该有色物质特征的信号传输给计算机处理系统PC处理,得到试样谱图。硅胶固相萃取小柱的型号为DIKMAProElutSI,生产厂为迪马科技有限公司。推动液C是浓度为0.2mol/L的硫酸;反应液R是浓度为12mol/L的硫酸;光学流通池F的光程为20mm;检测波长为411nm,测其峰高,峰高y为138.9mV,然后根据回归方程y=3.3655x+78.658,计算公示样品中胆固醇的浓度x为17.9mg/L,最后计算得到地沟油中胆固醇的含量为111.9mg/kg。冷却反应器L为内径为1.0mm聚四氟乙烯螺旋状盘管,冷却方式为循环水冷却,冷却反应后的液体;反压圈Y为内径为0.5mm聚四氟乙烯螺旋状盘管,反应液与试样反应过程中产生热,易产生气泡,设置反压圈Y增加废液W出口的排除压力,抑制气泡产生。实施例3:火锅油中胆固醇含量的测定方法(1)将过滤去除固体杂质和水分的火锅油充分混匀,精确称取1.0g样品于配有螺旋塞离心管中,加入10mL正己烷,涡旋混匀后得到油脂溶液;(2)将油脂溶液加入硅胶固相萃取小柱,从该小柱的底部孔弃去流出液;再用8mL体积比为正己烷:乙醚(V:V=98:2)溶液淋洗,弃去流出液;最后用45mL体积比为正己烷:乙醚(V:V=92:8)溶液淋洗,收集流出液备用。(3)将上述(2)步骤的备用收集流改于旋转蒸发仪干燥,转蒸发仪在真空度350KPa,温度为48°C条件下将所述的收集流浓缩至30μL,将浓缩的收集流与8mL显色液溶解制得胆固醇含量分析样品;所述的显色液是重量/体积比为邻苯二胺(g):冰乙酸(L)=0.04g/L的溶液。(4)测基线:将流动注射自动分析仪设置在进样状态,进样阀V设置在分析状态;在低压泵P的作用下,反应液R经显色液流路,推动液C经推动液流路后,使反应液R和推动液C在三通混合器M相混合形成混合液,反应液R和推动液C的混合液经冷却反应器L进入光学流通池F,经光学检测器D将反应混合液特征的信号传输给计算机处理系统PC处理,得到基线;在基线测绘的同时,使试样S经样品流路和进样阀V进入进样环C₀并将进样环充满;(5)测试样:将流动注射自动分析仪转换至分析状态,使进样环C₀中的试样S在推动液C的推动下进入分析流路,使试样S进入分析流路;在分析流路中,试样S与反应液R在三通混合器M混合后,在冷却反应器L中发生反应,在此过程中形成有色物质,继而该有色物质进入光学流通池F,经光学检测器D将该有色物质特征的信号传输给计算机处理系统PC处理,得到试样谱图。硅胶固相萃取小柱的型号为DIKMAProElutSI,生产厂为迪马科技有限公司。推动液C是浓度为0.3mol/L的硫酸;反应液R是浓度为14mol/L的硫酸;光学流通池F的光程为18mm;检测波长为412nm,测其峰高,峰高y为106.9mV,然后根据回归方程y=3.3655x+78.658,计算公示样品中胆固醇的浓度x为8.4mg/L,最后计算得到火锅油中胆固醇的含量为84mg/kg。冷却反应器L为内径为1.0mm聚四氟乙烯螺旋状盘管,冷却方式为循环水冷却,冷却反应后的液体;反压圈Y为内径为0.5mm聚四氟乙烯螺旋状盘管,反应液与试样反应过程中产生热,易产生气泡,设置反压圈Y增加废液W出口的排除压力,抑制气泡产生。实施例4:猪油中胆固醇含量的测定方法(1)将猪油融化后充分混匀,精确称取0.5g样品于配有螺旋塞离心管中,加入6mL正己烷,涡旋混匀后得到油脂溶液。(2)将待油脂溶液加入硅胶固相萃取小柱,从该小柱的底部孔弃去流出液;再用7mL体积比为正己烷:乙醚(V:V=98:2)溶液淋洗,弃去流出液;最后用50mL正己烷:乙醚(V:V=98:8)溶液淋洗,收集流出液备用。(3)将上述(2)步骤的备用收集流改于旋转蒸发仪干燥,转蒸发仪在真空度320KPa,温度为50°C条件下将所述的收集流浓缩至10μL,将浓缩的收集流与5mL显色液溶解制得胆固醇含量分析样品;所述的显色液是重量/体积比为邻苯二胺(g):冰乙酸(L)=0.06g/L的溶液。硅胶固相萃取小柱的型号为DIKMAProElutSI,生产厂为迪马科技有限公司。推动液C是浓度为0.1mol/L的硫酸;反应液R是浓度为13mol/L的硫酸;光学流通池F的光程为25mm;检测波长为413nm,测其峰高,峰高y为129.8mV,然后根据回归方程y=3.3655x+78.658,计算公示样品中胆固醇的浓度x为15.2mg/L,最后计算得到猪油中胆固醇的含量为212.8mg/kg。冷却反应器L为内径为1.0mm聚四氟乙烯螺旋状盘管,冷却方式为循环水冷却,冷却反应后的液体;反压圈Y为内径为0.5mm聚四氟乙烯螺旋状盘管,反应液与试样反应过程中产生热,易产生气泡,设置反压圈Y增加废液W出口的排除压力,抑制气泡产生。